A krioprotektív perfúzió után a beteget nem egyszerűen folyékony nitrogénbe helyezik.
A beteget egy több napon át tartó, számítógép-vezérelt hőmérsékleti program szerint hűtik. A testbe helyezett érzékelők mutatják, hogy a különböző testrégiók együtt hűlnek, vagy veszélyes hőmérsékleti gradiensek alakulnak ki közöttük.
A hűtés során maga a mérnöki feladat is megváltozik. A hűtés kezdeti szakaszában a jégképződés korlátozása a cél, az üvegesedési pont közelében és alatta viszont a pontosság és a hőmérsékleti egyenletesség fontosabbá válik, mint a sebesség.
Miért szükséges a szabályozott hűtés
A krioprotektív anyagok csökkentik a jég elkerüléséhez szükséges hűtési sebességet. Lehetővé teszik, hogy a vízben gazdag szövet erősen viszkózus, üvegszerű állapotba kerüljön, jelentős kristályképződés nélkül.
Az üvegesedési hőmérséklet, vagyis a Tg, az oldat összetételétől, koncentrációjától és a mérési módszertől függ. Ez egy tartomány, nem egyetlen, minden élő szövetre érvényes küszöbérték.
Az emberi kriopreservációhoz használt oldatok esetében ez a tartomány jellemzően -120 °C és -135 °C között van.
E tartomány felett a túl lassú hűtés lehetővé teheti jégkristályok kialakulását és növekedését. Alatta az anyag egyre inkább egy törékeny szilárd testhez hasonlóan viselkedik.
Ha a felszín jóval gyorsabban hűl, mint a test belseje, a különböző régiók eltérő mértékben húzódnak össze. Az ebből eredő termomechanikai feszültség repedéseket okozhat.
Ez kevés hibalehetőséget engedő folyamat: a vitrifikáció előtt elég gyorsan kell hűteni, az üvegszerű állapot elérése után pedig szabályozni kell a hőmérsékleti gradienseket és a hűtés sebességét.
Lásd még a fagyasztás és a vitrifikáció közötti különbségeket, különös tekintettel a mögöttes fázisviselkedésre.
Az első generációs hűtődoboz
A Tomorrow.bio első generációs rendszere, az úgynevezett V1 hűtődoboz, teremtette meg a szabályozott, egész testre kiterjedő lehűtés műszaki alapjait.
A beteget egy erre a célra kialakított, szigetelt kamrába helyezik. A kamra kriogén környezetét számítógép vezérli, a hőelemek pedig több ponton mérik a hőmérsékletet.
A vezérlő nem folyamatosan maximális hűtést alkalmaz, hanem egy előre programozott görbét követ. Minden érzékelőcsatorna adatai bekerülnek a beteg hőmérséklet-történetébe.
Ez már alapvetően különbözik a közvetlen bemerítéstől. A rendszer a mért értékek alapján lassíthatja vagy módosíthatja a hűtést, illetve egy ideig változatlan hőmérsékleten tarthatja a kamrát.
A második generációs, Dewar-edény alapú rendszer
A Tomorrow.bio második generációs rendszere a szabályozott lehűtést egy kifejezetten erre a célra épített Dewar-edényben végzi.
A beteg a Dewar-edényben marad, amelynek fedele külön egységben foglalja magában a hűtőberendezést, a számítógépes vezérlést, a szelepeket, az érzékelők csatlakozásait és a hőelemek átvezetéseit.
A hőelemeket a beteg testének több pontján helyezik el. További érzékelők figyelik a Dewar-edény belsejének hőmérsékleti környezetét.
A rendszer így nemcsak a beállított célértéket követi, hanem azt is figyeli, milyen gyorsan hűlnek a beteg különböző mérési pontjai.
A számítógép a Dewar-edény hőmérsékleti viszonyait és a hűtés sebességét úgy szabályozza, hogy a mért értékek a protokoll által megengedett tartományban maradjanak.
Egy nagy testet hűtés közben nem lehet tökéletesen egyenletes hőmérsékleten tartani. A gyakorlati cél az eltérések minimalizálása, illetve annak elkerülése, hogy bármelyik mért régió veszélyesen előre vagy hátra kerüljön a többihez képest.
A Dewar-edény kialakítása egyúttal csökkenti a szabályozott lehűtés és a kriogén tárolás közötti áthelyezés szükségességét is. Ugyanaz a zárt edény stabil, lehetőleg egyenletes környezetet biztosít a beteg számára.
A célhőmérséklet nem egyenlő a beteg hőmérsékletével
A vezérlő gyorsan lehűtheti a környezetet. A test belsejét azonban nem tudja azonnal ugyanarra a hőmérsékletre hozni.
A hőnek a mélyebb szövetekből a testfelszín felé kell távoznia. A geometria, a testösszetétel, a krioprotektánsok eloszlása és az érzékelők elhelyezkedése mind hatással van a megfigyelt késésre.
Ezért nem elég egyetlen kamraérzékelő. Egy névleges -130 °C-os környezet nem bizonyítja, hogy a beteg minden mért pontja elérte a -130 °C-ot.
A vezérlőrendszernek egyszerre kell figyelembe vennie az abszolút hőmérsékletet és a csatornák közötti eltéréseket. A leglassabban és a leggyorsabban hűlő pont, valamint a szórás mértéke egyaránt fontos információt hordoz.
A hőelemek kalibrálása, elhelyezése és folyamatos működése is lényeges. A valószínűtlen mérési értékeket és az érzékelőhibákat jelölni kell, nem pedig ellenőrzés nélkül beleszámítani őket a hőmérsékleti görbébe.
A Tomorrow.bio háromlépcsős hőmérsékleti programja
A jelenlegi protokoll három elkülönült szakaszból áll. Az itt szereplő értékek az adott berendezéshez és krioprotektív eljáráshoz tartozó üzemi értékek, nem pedig valamennyi vitrifikációs rendszerre érvényes állandók.
1. Gyors hűtés -130 °C felé
Az első szakaszban a beteget a szárazjég hőmérsékletéről körülbelül -130 °C felé hűtik, olyan gyorsan, amennyire ezt a mért hőmérsékleti eltérések biztonságosan lehetővé teszik.
A sebesség itt azért fontos, mert a nem elég jól átitatott régiókban jég képződhet még azelőtt, hogy a szövet üvegszerű állapotba kerülne.
A számítógép nem csak az eltelt időt követi, hanem folyamatosan figyeli a hőelemeket, és ennek megfelelően módosítja a beteg körüli hűtési környezetet.
2. Szabályozott felmelegedés -120 °C felé
Miután a hőmérséklet elérte a körülbelül -130 °C-ot, az aktív hűtést csökkentik, és a beteg természetes módon melegedhet vissza körülbelül -120 °C-ra.
Ez a szakasz a mechanikai feszültségek oldását szolgálja. A Tg közelében a krioprotektált anyag még elegendő molekuláris mozgékonysággal rendelkezik ahhoz, hogy a felhalmozódott mechanikai feszültség egy része lecsengjen.
A visszamelegedés emellett lehetőséget ad arra, hogy a melegebb és hidegebb régiók hőmérséklete közelebb kerüljön egymáshoz, mielőtt az anyag merevebb, üvegszerű állapotba kerül.
A pihentetés nem fordítja vissza a korábban keletkezett biológiai károsodást. Célja szűkebb: a hőmérsékleti gradiensek és az egyenetlen összehúzódás okozta feszültségek csökkentése.
3. Hűtés -196 °C-ra, óránként körülbelül 1 °C-os ütemben
Körülbelül -120 °C-tól a célzott hűtési ütem óránként körülbelül 1 °C, amíg a beteg hőmérséklete el nem éri a folyékony nitrogén hőmérsékletét.
Ez az utolsó, 76 fokos szakasz önmagában is nagyjából három napig tart, még a megtartási szakaszok és vezérlési beavatkozások nélkül is.
Az óránkénti 1 °C-os ütem fenntartása egy nagy, hőmérsékletileg egyenetlen testben nem egyszerű időzítési kérdés, hanem vezérléstechnikai feladat.
A vezérlőnek folyamatosan szabályoznia kell a Dewar-edény belső környezetét, hogy a belső hőelemek által mért hőmérsékletek közel azonos ütemben csökkenjenek, túlzott gradiensek nélkül.
Ha egy régió lemarad, a környezet erőteljesebb hűtése egy másik régiót túlhűthet. A pontosság azt jelenti, hogy a teljes érzékelőrendszert kell egyensúlyban tartani, nem egyetlen mérési értéket kell követni.
Miért tudományosan is megalapozott a pihentetési szakasz
A nagy léptékű vitrifikációs kutatások két, egymással versengő kockázatot azonosítanak: a Tg felett a túl lassú hűtést, a Tg körül és alatta pedig a túlzott mechanikai feszültséget.
Egy 2024-es, emberi szerv méretű vitrifikációt vizsgáló kutatás több belső mérőszondát alkalmazott, és arra jutott, hogy a pihentetési szakasz csökkenti a hőmérsékleti gradienseket, mielőtt az anyag üvegszerű állapotba kerül.
Ugyanez a vizsgálat azt is megállapította, hogy a pihentetési szakaszt követő lassú hűtés segít megelőzni a nagy hőmérsékleti gradiensek és feszültségek ismételt kialakulását.
Egy másik termomechanikai kutatás szerint a Tg közelében beiktatott pihentetési szakasz jelentősen befolyásolja a maradó feszültséget, és mérsékli annak függését a korábbi hűtési sebességtől.
Ezek a vizsgálatok alátámasztják a vezérlési stratégia alapját. Nem igazolják azonban külön minden egyes, a Tomorrow.bio egész testre vonatkozó protokolljában szereplő pontos célértéket.
A teljes emberi test nagyobb és hőmérsékletileg egyenetlenebb, mint a laboratóriumi oldatok vagy szervek. Ezért továbbra is szükség van közvetlen hőmérsékletmérésekre és a lehűtés utáni képalkotó vizsgálatokra.
Mit rögzít a számítógép
A lényeges eredmény nem pusztán az az üzenet, hogy „a lehűtés befejeződött”. Érdemi információt az egyes hőmérsékleti csatornák teljes idősora szolgáltat.
A feljegyzésnek tartalmaznia kell a hűtési ütemeket, a megtartási szakaszokat, a visszamelegedéseket, az érzékelők közötti gradienseket, a vezérlő beavatkozásait, a riasztásokat és a tervezett görbétől való eltéréseket.
Ezek az adatok a kriopreservációs minőségi értékelés részévé válnak.
A lehűtés után, folyékony nitrogén hőmérsékletén végzett szabványosított CT-vizsgálat kimutathatja a krioprotektánsok eloszlását, a jégképződést, a nagyobb deformációkat és a törésvonalakat, amelyek a hőmérsékleti adatokból önmagukban nem derülnek ki.
Miért a folyékony nitrogén hőmérsékletén zárul le a folyamat
Normál légköri nyomáson a nitrogén forráspontja körülbelül 77,34 kelvin, azaz mintegy -195,8 °C, a NIST Chemistry WebBook adatai szerint.
A folyékony nitrogénben történő tárolás passzív. Amíg elegendő folyékony nitrogén van a tartályban, a forrási egyensúly gépi hűtés nélkül is stabil kriogén környezetet biztosít.
A szabályozott lehűtés csak akkor ér véget, amikor a beteg hőmérséklete eléri ezt a stabil állapotot. A tárolás nem helyettesíti a lehűtést.
A következő szakasz műszaki megoldásait és az azokkal járó kompromisszumokat a modern kriogén Dewar-edényekről és a köztes hőmérsékletű tárolásról szóló írás ismerteti.
Röviden: A Tomorrow.bio számítógép-vezérelt hűtést és belső hőmérséklet-érzékelőket alkalmaz. A folyamat az üvegesedési tartomány közelében gyors hűtést alkalmaz, majd feszültségoldó szakasz után lassan hűt tovább -196 °C felé.
Fedezze fel ezt a gyakorlati eszközt
Használja az interaktív eszközt a cikkben szereplő kérdés feltárásához.
Az interaktív eszköz betöltése…
További olvasmányok